3D電子顯微鏡是一種利用逐點照明和空間針孔調制來去除樣品非焦點平面的散射光的光學成像手段，相比于傳統成像方法可以提高光學分辨率和視覺對比度。不同的3D電子顯微鏡成像原理可能有所差異，以45°設計3D電子顯微鏡為例，3D電子顯微鏡成像原理具體如下：

掃描電子顯微鏡原理及應用應該是因為光在不同介質的傳播速度不同造成的。包括照相機也是這個原理。二倍焦距以外，倒立縮小實像，一倍焦距到二倍焦距，倒立放大實像，一倍焦距不成像，一倍焦距以內，正立放大虛像， 成實像物和像在凸透鏡異側，成虛像在凸透鏡同側。3D電子顯微鏡利用從一個點光源發射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦。共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡，將已經通過透鏡的反射光折向其它方向，在電子顯微鏡原理其焦點上有一個帶有“針孔”的擋板，小孔就位于焦點處，擋板后面是一個光電倍增管。

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