在了解暗視野顯微鏡的使用前，可以首先了解下其檢測原理；利用自身的暗場聚光鏡，不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射投向被檢物體，使照明光線不直接進入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光而形成的明亮的圖象。而這也導致其與普通顯微鏡是使用有所區別。

基于以上暗視野顯微鏡的原理，暗視野顯微鏡鏡在檢時。暗視野顯微鏡使用方法只能觀察到物體的存在，運動及外部形態，而很難分辨其內部結構。在操作時，選厚薄在1.0~1.2 mm 的干凈載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片調節聚光鏡光圈，直到光源的光圈孔調至最大。在聚光器上放一大滴香柏油，將標本置載物臺上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不能有氣泡發生）。在將制作好的細菌懸滴標本片置于載物臺上，上升聚光器至頂部使油與載玻片接觸。

然后暗視野顯微鏡的放大光源，進行聚光器光軸調節及調焦。用10倍的物鏡找到被檢物像，關小聚光器虹彩光圈至可在視野中看到視場光闌的輪廓，再上下緩慢調整聚光器，這樣會使視場光闌的像變得清晰，如視場光闌不在場中央，利用聚光器外側 的兩個調節鈕進行調整，當亮光點調到場中央后，再將其開大，即可進行觀察。

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